单分子测序（SMS）是在第一代Sanger测序、第二代NGS高通量测序时候的基础上发展起来的第三代基因测序时候。因测序时DNA分子无需PCR扩增性爱巴士电影，SMS达成了对每一条DNA分子的单独测序而得名

HelicoBioscices公司基于合成测序表面，于2008年推出了寰球上第一款单分子测序平台HeliScope，但其测序的平均读长相对较短，是以系统举座测序特别率较高。之后出现了单分子的长读长测序时候，现在照旧达成贸易化的长读长测序时候主要有PacificBiosciences公司的单分子及时测序时候（SMRT）和OxfordNanopore公司的纳米孔测序时候

SMS和SMRT时候主若是将4种不同的碱基更正为荧光信号，然后通过更正放大后的信号对碱基进行永诀。而纳米孔测序时候则是将4种碱基挽回为电信号，然后对电信号进行汇集、整理、更正与数据输出，与单分子荧光测序时候在信号处理上存在较大各别，故而纳米孔测序时候也被称为第四代基因测序时候

□郝玮琳

纳米孔测序的道理

纳米孔单分子测序时候是基于电信号测序的时候，相干于其他测序时候，纳米孔测序时候的样本处理极其粗略，无需DNA团员酶或者连气儿酶，也无需dNTPs（脱氧核苷三磷酸），其测序过程中包含了以下4种枢纽物资。

纳米孔卵白：不错镶嵌到细胞膜中手脚离子或分子通说念的跨膜卵白，具有自然的卵白纳米孔。

多聚物薄膜：跨膜卵白被镶嵌到高电阻率的由东说念主工合成的多聚物膜中，膜两侧是离子溶液，在两侧加不同的电位，离子就会在孔中流动，变成电流。

马达卵白：在纳米孔测引言库构建时，需要在商讨上连气儿一种马达卵白，用于将DNA或RNA分子推入纳米孔中。

连气儿臂：用于锚定DNA或RNA链，注目其在溶液中激荡，并使其插足纳米孔中。

将东说念主工合成的多聚物膜浸没在离子溶液中，膜上布满了由解旋酶和卵白孔两部分构成的跨膜通说念卵白纳米孔，在膜两侧施加不同电压变成电压差，由于多聚物膜弗成导电，电流只可通过纳米孔进行传导。连气儿臂素质待测链插足纳米孔，待测链在马达卵白的牵引下经解螺旋后以单链方式穿过纳米孔。不同碱基在通过纳米孔的恒定的电场时会引起电流不同幅度的变化，使用计较机软件及东说念主工智能算法不错识别并预计出碱基类型，从而完成DNA或RNA测序。

纳米孔的类型

纳米孔有生物纳米孔、固态纳米孔两大类型。

生物纳米孔

纳米孔测序的见识在上世纪80年代被初度建议，况兼跟着纳米孔卵白及马达卵白的时候发展而得以达成。第一个被发现不错通过DNA或RNA影响离子电流并能使之被检测到的纳米孔卵白，是1996年Kasianowicz等东说念主建议的α-溶血素卵白。但是，由于DNA通过纳米孔的速率过快，而无法获取灵验的电流信号。2010年，策划东说念主员发现耻垢分枝杆菌卵白A（Msp-A）纳米孔不错减缓DNA穿过纳米孔的速率，栽培DNA单碱基的检测颖悟度。随后，2014年策划者发现使用phi29DNA团员酶手脚马达卵白性爱巴士电影，不错限度DNA穿过纳米孔的速率。

生物纳米孔是由某种卵白质分子镶嵌在磷脂膜上变成的自然纳米孔，不错进行活泼的生厌世学修饰。但是，生物纳米孔在膜褂讪性、电流噪声等方面的问题在一定进程上截止了其发展。OxfordNanopore公司在卵白纳米孔的应用方面取得了一定表露，该公司的GridION和MinION系统即是基于生物卵白纳米孔的测序平台。

固态纳米孔

固态纳米孔主若是在氧化硅、石墨烯等固态材质上通过离子束刻蚀等时候制备出的纳米孔，因具有尺寸可调、可靠性高、易修改等优点，固态纳米孔被粗拙应用于DNA测序、卵白质检测和能量挽回等策划规模，其中比较常见用于DNA检测的固态纳米孔是氮化硅纳米孔和石墨烯纳米孔。

比拟于生物纳米孔，固态纳米孔在褂讪性、电流噪声、工艺集成方面有着昭着的上风，但是受限于半导体工艺制造水平，固态纳米孔的制造比较复杂且资本较高。

纳米孔测序的特色

比拟于其他测序身手，纳米孔测序手脚一种新式测序时候，在资本、测序速率、测序读长和准确率等诸多方面有着不同的特色，上风极端显赫。

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较长的测序读长

纳米孔测序时候应用碱基穿过纳米孔时电信号的改变达成测序，表面上可检测通过纳米孔的一王人核酸序列，读长长度仅受限于所测单链DNA的长度。测序长度越长不错提供的基因组拼装就越竣工、越连气儿，在具有大型结构变异和高水平近似区域的基因组中的上风就越显赫。

可快速及时测序

比拟于其他传统测序身手，纳米孔测序信得过道理上作念到了动态及时测序，可边测序边输出后果，用户不错在测序早期了解样本的质地和现象，也不错在获取豪阔的数据后住手测序。同期，纳米孔测序时候测序所需的时长也远低于其他测序身手，不错从简操作时代，镌汰测序资本。

修复粗略便携

现在较为常用的MinION测序仪，分量随意100克，长度约为10厘米，可使用高速USB插入电脑，被称为“U盘测序仪”。因具有便携性，不错在实践室、旷野以致天外等复杂环境下完成及时测序，不错保证处理突发情况的时效性。

可平直对RNA进行测序

纳米孔测序不错平直对各样原始DNA和RNA进行测序，不仅不错量入为出时代和资本、竣工地保留碱基修饰的信息，还能幸免将RNA逆转录为DNA扩增所产生的偏向性及可能引入的突变。其文库制备的责任经过也较为粗略。

诚然纳米孔测序时候与前几代测序时候比拟，在资本、测序速率等方面上风显赫，但是现在还处在起步阶段，从测序道理到制造工艺都存在许多问题。

领先，检测准确度相对较低，是纳米孔单分子测序发展过程中一直勤苦于措置的问题。策划东说念主员除了优化纳米孔和马达卵白外，还在尝试通过开垦算法来措置这一问题。其次，检测通量和文库产量也截止了该时候的应用。现在仍然缺少针对少许样品的高产量文库制备和测序行动经过。此外，该时候也并非老是概况从临床样本中获取豪阔大且竣工的高分子量DNA和全长RNA。纳米孔测序时候仍需在读取长度和产量之间进行衡量。

纳米孔测序时候的应用

纳米孔测序时候测序长度长、速率快的特色，让该时候在某些场景中具有很大的应用上风；但通量偏低、价钱高、准确度偏低也严重截止了它的发展。由此看来，对读长条件高，但是对序列数和准确度条件较为宽松的应用场景才是纳米孔测序的最适应用场景。

大基因组拼接

在以往基于短片断的基因组拼接中，一些动植物基因组自己具有多倍体、高度近似、高度杂合的性情，导致基因组拼接异常勤苦。而纳米孔测序时候读长较长的特色，故意于大基因组的拼接，不错极大栽培基因组的竣工性。

全长转录组获取

以往的转录组分析由于无法平直对RNA进行测序，时常需要先对mRNA进行打断，再回转录为cDNA，无法获取和分析全长转录本。纳米孔测序时候的长读长特色不错粗略准确地识别各基因的多个同源异构体，况兼不错平直测序RNA，平直识别RNA的碱基修饰。

大片断结构变异检测

基因组上会产生好多与东说念主类疾病关连的大片断结构变异（如缺失、倒位和易位等），短测序读长无法准确检测这些变异，而纳米孔测序时候不错进行大片断结构变异的检测，在疾病策划等方面具有精雅的发展出路。

病原微生物快速卤莽

纳米孔测序具有及时、快速的特色，不错在聚积点平直进行测序，及时得到序列信息进行物种分类卤莽，完成病原微生物的快速卤莽。现在，纳米孔测序时候在传染病、临床感染病原快速检测中已有较为粗拙的应用策划。

（作家单元：国度药监局医疗器械时候审评中心）性爱巴士电影